免疫療法通過靶向免疫檢查點阻斷(ICB)技術，重新激活潛伏的癌癥免疫系統，實現全身性的腫瘤清除。然而，95%的結直腸癌(CRC)病例在微衛星不穩定性檢測中呈陰性，這會引發免疫系統的嚴重抑制和T細胞的大量消耗，從而形成免疫抑制性腫瘤微環境(ITM)，并導致對ICB所用的單抗產生低過敏性免疫反應。PD-1/PD-L1抗體耐藥性產生的重要因素在于T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM3)的上調。作為新型免疫檢查點分子，TIM3不僅能抑制T細胞活性，還能特異性破壞HMGB1誘導腫瘤細胞免疫性死亡的能力。

CRISPR/Cas13a是一種RNA核酸內切酶，除了作為強大的RNA編輯工具外，還具有開發成癌癥治療系統的潛力。在crRNA引導下特異性識別后，Cas13a會對目標基因實施強效RNA沉默，并通過“旁系切割效應"進一步促進腫瘤細胞死亡，有效抵抗腫瘤的應激反應逃逸機制。Cas13a系統靶向RNA而非基因組DNA，因此不會引發額外的突變。此外，Cas13a在靶向單鏈RNA轉錄前不具備切割活性，這使得通過篩選腫瘤中過表達的目標基因，能夠實現高度的生物安全性。盡管CRISPR/Cas13a在多靶點癌癥治療中優勢顯著，但為了避免體內持續激活的Cas13a高劑量遞送帶來的安全風險，仍需實現精準的腫瘤定位。受小分子自組裝前藥體系的啟發，具有“無載體"遞送特性的納米前藥能夠有效解決載藥量低、滲透性差、穩定性不足、藥代動力學特征不佳及副作用嚴重等缺陷。此外，納米組裝體有利于與兩親性染料結合，從而構建出一體化的診療系統。

1.SRC的制備和表征

本研究設計了一種級聯自解納米組裝體(SRC)，其核心是由SN38前藥與靶向TIM3的Cas13a/RNP前藥自組裝形成的超分子納米復合物(SR)，在外層包裹低濃度兩親性的DSPE-TK-PEG-CH1055(p-CH1055)作為納米系統表面涂層。亞油酸與偶氮苯的共軛作用促進了SN38和Cas13a/RNP的自組裝及控釋，而琥珀酸酐的引入則增強了Cas13a/RNP的結合能力。聚不飽和脂肪酸無需外源輔料即可實現自組裝，其中亞油酸還被證實能確保集成自組裝體系在體內保持高穩定性，避免快速解聚和代謝。通過將疏水性CH1055轉化為兩親性探針的p-CH1055，不僅實現了腫瘤成像功能，還顯著提升了SRC的體內穩定性、生物相容性和藥代動力學特性。

2.SRC的級聯自解與穩定性

從“外殼"到“核心"的級聯自解過程始于對高活性氧(ROS)腫瘤微環境的響應，SRC在自解時釋放游離的CH1055，實現腫瘤的近紅外II(NIR-II)成像并阻止熒光淬滅；在第二次自解時，由缺氧環境刺激SN38和Cas13a/RNP實現靶向控釋。 

3.SRC和RNA編輯的高效細胞攝取

Cas13a/RNP在SRC中具有高活性，Cas13a核糖核蛋白復合物(RNP)的功能性和高RNA編輯效率使其能夠被應用于癌癥治療。此外，SRC在RNA的編輯效率上優于siRNA和脂質轉染，這種差異可能源于納米系統更強的細胞攝取能力。

4.SRC的細胞毒性及抗腫瘤作用機制

Cas13a能夠通過高效的RNA降解顯著抑制TIM3的表達。SN38和Cas13a/RNP均能調控STING信號通路，顯著上調STING通路的相關蛋白，并且相較于單獨使用，SRC組合表現出更顯著的協同激活效應。此外，SRC通過激活CRT、HMGB1及Caspase 3等誘導免疫細胞死亡效應，證實了SRC對低氧CRC細胞的體外療效，為CRC的治療提供了初步依據。

5.PD-L1耐藥CRC的體內治療

單獨使用SN38或α-PD-L1治療僅表現出輕微的抗腫瘤效果，而SRC+α-PD-L1聯合治療則展現出最佳的腫瘤抑制效果，腫瘤細胞死亡率和凋亡水平以及小鼠存活率均顯著優于單獨使用游離藥物或SR，并且具有高生物安全性。SRC優異的治療效果和生物安全性表明其作為新型輔助治療策略，在增強PD-L1靶向ICB療法治療CRC方面具有巨大潛力。

6.RNA測序分析

SRC對免疫激活和趨化因子分泌起到同樣的促進作用，通過上調多種基因的轉錄水平，有效激活免疫系統，此過程涉及多種信號通路，包括與Th1和Th2細胞分化相關的免疫通路、IgA生成、細胞因子受體、A2AR及IL-17信號傳導，以及細胞周期調控、細胞增殖、細胞死亡、細胞凋亡相關通路等。此外，SN38的免疫原性細胞死亡(ICD)效應可以誘導DNA修復，不僅參與調控cGAS-STING信號通路，還影響抗原的加工與呈遞過程，為免疫系統提供特異性腫瘤抗原。SRC+α-PD-L1聯合治療在先天性免疫和獲得性免疫中均表現出了協同效應，通過先天性免疫系統與適應性免疫系統的多效聯合作戰，促進細胞毒性T淋巴細胞浸潤腫瘤，逆轉ITM效應，從而有效抑制腫瘤生長。

7.聯合治療的協同免疫激活

SN38誘導腫瘤細胞DNA斷裂，并觸發NK細胞活化和樹突狀細胞成熟。基于SN38與TIM3基因編輯技術的SRC組合療法具有顯著的免疫協同效應，SRC作為新輔助治療方案與已獲批的PD-L1靶向臨床藥物聯用時展現出優異的療效。該策略通過先天免疫與獲得性免疫的聯合作戰為高效的免疫治療開辟了新途徑，有望突破CRC的ITM及PD-L1耐藥性，實現治愈。

本研究開發了一種基于SN38與Cas13a/RNP雙前藥的級聯自解納米組裝體SRC，通過包裹ROS響應探針實現外部封裝。SRC不僅穩定性優異，還能根據腫瘤微環境的高ROS和低氧特性實現級聯自解響應：該探針在腫瘤微環境中被激活后，會因解離為單分子而觸發CH1055的近紅外II期成像，在缺氧環境中的二次自解可實現SN38和Cas13a/RNP的靶向控釋。

在體外實驗中，SRC成功實現了CRC細胞的高效攝取和靶向基因編輯。Cas13a蛋白通過旁系切割效應，有效抑制了癌細胞增殖并誘導其凋亡。此外，在PD-L1耐藥的原位和異種移植模型中，SRC展現出優異的CRC抑制效果，通過增強CTL介導的腫瘤免疫浸潤，顯著提升α-PD-L1抗體在體內的治療效果。SRC還能誘導細胞介導的ICD，激活cGAS-STING先天免疫通路，促進樹突狀細胞成熟、NK細胞增殖，通過靶向調控新型免疫檢查點TIM3的RNA編輯技術，協同激活先天性和適應性免疫系統，顯著改善ITM。

總之，SRC為SN38化療與TIM3基因治療的聯合應用提供了高效策略，這種結合方案有望在降低副作用的同時增強PD-L1抗體治療效果。因此，該技術在未來PD-1耐藥CRC的臨床治療中具有良好的應用潛力。