文獻標題：Phytochemical natural killer cells reprogram tumor microenvironment for potent immunotherapy of solid tumors
發表期刊：Biomaterials
IF：15.304
一作單位：北京理工大學生命科學學院
研究背景
過繼性細胞移植(ACT)是通過體外激活擴增供體淋巴細胞來誘導抗腫瘤免疫反應，自然殺傷細胞(NK細胞)在ACT中具有毒性較低、反應率更高及作用譜更廣等明顯優勢。此外，由于NK細胞缺乏抗原特異性表面受體且不會引發移植物抗宿主病(GvHD)，使用同種異體NK細胞可加速治療進程。 激活NK細胞以增強其細胞毒性是提升NK療法療效的關鍵。基因工程是目前普遍的NK細胞激活手段，然而NK細胞的轉染和基因操作難度遠高于T細胞，且基因工程產物仍存在諸多問題。作為替代方案，糖工程改造和脂質體修飾等化學修飾方法也有報道，但這些方法通常存在效率低、穩定性差的缺陷。 即便實現了有效激活，要在實體瘤中充分發揮過繼性NK細胞的治療潛力仍十分困難，因為腫瘤微環境(TME)中的多種免疫抑制機制會嚴重損害NK細胞的效應功能。特別是缺氧條件和活性氧簇(ROS)會顯著抑制其抗腫瘤活性，甚至誘發NK細胞凋亡；而白細胞介素-37(IL-37)、轉化生長因子-β(TGF-β)等癌癥相關因子還會通過多種途徑對NK功能產生負面影響。目前針對免疫抑制性TME的逆轉方案僅限于使用抑制劑或靶向分子，但這些方案通常僅針對特定免疫逃逸相關因子，而TME對NK細胞的影響是普遍的，因此效果欠佳。迄今為止，能克服TME多重抑制作用的方案并不多，更遑論同時實現TME抑制解除與NK細胞激活的雙重目標。 本研究通過賦予NK細胞植物化學特性，實現了對實體瘤的有效免疫治療。通過膜融合技術，用天然類囊體(Tk)膜修飾NK細胞，構建出植物化學修飾的NK細胞(PC-NKs)。這種Tk工程化處理能顯著激活NK細胞，Tk膜上的抗氧化酶可抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)，進而提升NK細胞中激活受體和細胞毒性效應分子的表達水平。系統性給藥后，PC-NKs細胞能精準靶向腫瘤組織，并借助Tk膜上的過氧化氫酶深度重編程TME，從而顯著增強直接殺傷能力并激活免疫性TME。該方案在實現顯著治療效果的同時幾乎不引發異常反應，直接殺傷作用與強免疫調節的協同效應產生了強大的抗癌效果，為開發針對實體瘤的高效NK細胞療法提供了新思路。
實驗結果
通過膜融合技術，成功將Tk膜與NK細胞融合，形成PC-NKs細胞。該融合過程不影響NK細胞的活性和增殖能力，Tk組分被完整轉移至NK細胞，從而賦予NK細胞類囊體植物化學功能。
Tk膜上的抗氧化酶通過分解細胞內ROS，誘導GSK-3β抑制，進而上調NF-κB和p-eIF2B水平，最終實現PC-NKs細胞的顯著活化。Tk工程有效促進了NK細胞激活受體的表達，特別是核心受體NKG2D，同時降低了抑制性受體NKG2A的表達。NKG2D表達提升促進了NK細胞與腫瘤細胞的特異性結合，進而誘導靜息態NK細胞中溶解顆粒的極化，并刺激促炎細胞因子分泌。受體表達水平與細胞毒性效應分子分泌的同步顯著增強，共同證實了Tk對NK細胞的有效激活作用。因此，PC-NKs細胞對腫瘤細胞展現出比天然NK細胞更強的細胞毒性。
除了直接殺傷腫瘤細胞外，NK細胞在協調和啟動抗癌適應性免疫反應中也發揮著關鍵作用。高活性的PC-NKs細胞能產生多種免疫調節相關分子，DNAM-1、FLT3L和CCL5這些關鍵配體不僅能將樹突狀細胞(DCs)募集至TME并促進其成熟，增強成熟DC激活T細胞的能力。同時還能通過受體-配體相互作用誘導巨噬細胞極化，將M2型巨噬細胞重編程為M1型表型，被PC-NKs細胞處理后的M2型巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬率顯著上升。除了通過吞噬作用直接殺傷腫瘤細胞外，M1型巨噬細胞還能有效產生H?O?，這有利于PC-NKs細胞誘導的TME氧合作用，證實了PC-NKs細胞顯著的免疫調節能力。
由于過氧化氫酶作用，腫瘤細胞和TME中大量存在的H?O?會被PC-NKs細胞高效氧化，從而實現H?O?濃度下降與O?含量上升的同步效應。H?O?分解與缺氧緩解對過繼性NK治療具有特殊意義。一方面，高濃度的H?O?易影響NKs的活性與功能。通過Tk膜上的過氧化氫酶作用，對NK細胞進行工程化改造，能在高H?O?水平環境中有效提升其活性，從而使PC-NKs細胞在實體瘤中的抗腫瘤性能顯著增強。另一方面，腫瘤組織中的缺氧環境會誘導腫瘤細胞表面NKG2D的特異性配體MIC分子脫落，從而促進其對免疫監視的抵抗。PC-NKs細胞上NKG2D表達量的增加以及腫瘤細胞上MICA分子的表達，使得PC-NKs細胞與腫瘤細胞之間能夠形成有效的受體-配體結合，這是NK細胞介導的腫瘤細胞殺傷作用所必需的條件。此外，PC-NKs細胞表現出更強的腫瘤聚集性和明顯更慢的清除速率，證實了其更具活性的腫瘤靶向與識別能力。
PC-NKs細胞治療組表現出更強的腫瘤細胞凋亡誘導效應和更低的腫瘤細胞增殖活性，腫瘤抑制率顯著升高，腫瘤生長顯著延緩，腫瘤組織中更多癌細胞出現結構改變或死亡，腫瘤重量和體積顯著降低，小鼠生存期顯著延長，并且未觀察到肺轉移跡象，轉移指數與分級結果進一步證實PC-NKs細胞治療顯著減輕了肺轉移負荷，驗證了PC-NKs療法相較于傳統過繼性NK療法的抗腫瘤性能。此外，PC-NKs細胞治療組小鼠的主要器官未出現明顯損傷，體重和血液生化指標均無異常，驗證了該療法作為癌癥治療手段的安全性。PC-NKs細胞的浸潤能力顯著增強，這可能源于其高度活化和改善的腫瘤富集特性。PC-NKs細胞浸潤的增加顯著促進了DC細胞的成熟，增強成熟DC激活T細胞的能力。除免疫細胞外，免疫刺激細胞因子也是評估免疫反應的重要指標，PC-NKs細胞治療組能誘導高水平的TNF-α和IFN-γ分泌，同時產生低量的TGF-β。這些數據共同證明，在荷瘤小鼠模型中，PC-NKs療法比單一NK療法具有更強的免疫刺激能力，從而產生更優異的抗腫瘤治療效果。
PC-NKs細胞治療組中能夠進行主要組織相容性復合體(MHC)I類分子介導的交叉呈遞(CD11c+MHCI+ DCs)的成熟DCs比例更高，促進了具有優異克隆多樣性和細胞毒活性的T細胞增殖。因此，PC-NKs細胞治療能夠促進建立有效的免疫記憶效應，這對于良好的癌癥預后至關重要。
討論
通過膜融合方式用囊泡修飾NK細胞，在保持NK細胞活力和增殖能力的同時，通過抗氧化酶激活的ROS-GSK3β–NF–κB/eIF2B信號通路顯著增強了其活性。實驗結果表明，激活配體NKG2D與細胞毒性效應分子的表達顯著提升，NK細胞的抗腫瘤細胞毒性明顯增強。經系統性給藥后，高度活化的PC-NKs細胞高效富集于腫瘤組織，在分解H?O?的同時改善TME的缺氧狀態。這使腫瘤細胞表面配體MICA的表達水平大幅上升，進而強化了NK細胞與腫瘤細胞的結合體形成，顯著提升了腫瘤殺傷能力。此外，PC-NKs細胞能有效重編程針對腫瘤的免疫應答，使細胞毒性免疫細胞及細胞因子得到明顯改善。直接殺傷作用與多重免疫調節功能的協同效應，在實體瘤治療中展現出令人振奮的抗癌效果。顯然，將Tk植物活性成分轉移至NK細胞，極大提升了其在實體瘤治療中的表現。該策略還具有快速、簡便、無需基因改造等特點，可推廣至其他基于細胞的療法。 T細胞與TME中的ROS廣泛參與T細胞的失活、凋亡及功能抑制，因此，用Tk對T細胞進行工程化改造，也將成為提升T細胞腫瘤免疫應答和治療效能的潛力策略。同理，只要其他淋巴細胞活性受ROS和缺氧影響，理論上均可通過Tk膜融合技術提升其活性。下一代PC-NKs產品可通過工程化改造分泌游離因子或呈遞膜結合受體，從而增強體內增殖與持久性、腫瘤歸巢及浸潤能力，并進一步提升NK細胞的殺傷效力。
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